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    提高實(shí)驗(yàn)和質(zhì)量的實(shí)用技巧

    發(fā)布時(shí)間: 2024-03-20  點(diǎn)擊次數(shù): 582次

    1.提高實(shí)驗(yàn)的效率

    1)實(shí)驗(yàn)前有計(jì)劃安排、預(yù)備方案或者“車輪戰(zhàn)"(細(xì)胞實(shí)驗(yàn))

    一般從基礎(chǔ)的培養(yǎng)細(xì)胞開始,開始實(shí)驗(yàn)時(shí),實(shí)驗(yàn)方法一般來自于實(shí)驗(yàn)室或者文獻(xiàn)中條件優(yōu)化以及自我推測及驗(yàn)證,因此做實(shí)驗(yàn)之前預(yù)想實(shí)驗(yàn)方案有助于我們不至于“手忙腳亂"。


    以實(shí)驗(yàn)前的細(xì)胞鋪板實(shí)驗(yàn)為例:

    表1 常用細(xì)胞培養(yǎng)體系:

    圖片

    細(xì)胞鋪板的孔數(shù)一般取決于我們后期實(shí)驗(yàn)的目的,實(shí)驗(yàn)前了解各類細(xì)胞的鋪板數(shù)量以及培養(yǎng)基添加量都十分重要。以病毒或者細(xì)菌感染細(xì)胞模型來說,我們需要一個(gè)比較準(zhǔn)確數(shù)量級的細(xì)胞數(shù)目和病毒或菌液濃度得后期實(shí)驗(yàn)的MOI值,細(xì)胞計(jì)數(shù)和病毒及菌液濃度測定也很關(guān)鍵;


    細(xì)胞鋪板:我們需要收集盡可能多的細(xì)胞,原因是當(dāng)我們剩余出來的細(xì)胞可用于細(xì)胞傳代繼續(xù)保留,可若是鋪板數(shù)目達(dá)不到(重新離心收集細(xì)胞浪費(fèi)時(shí)間)可能會導(dǎo)致加藥濃度過大使得細(xì)胞大量死亡而影響后期實(shí)驗(yàn),比如你要提取RNA或者蛋白,細(xì)胞數(shù)目不足,后期的RNA濃度或者BCA測蛋白濃度的結(jié)果都不是非常理想繼而影響后面實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展。


    2)具體安排(Western blot實(shí)驗(yàn))

    從試驗(yàn)干擾開始(給藥處理),根據(jù)實(shí)驗(yàn)步驟來講,完整的Western blot實(shí)驗(yàn)預(yù)計(jì)2-3天。

    (1)以給藥時(shí)間24h為例:24h后,收集細(xì)胞提取蛋白,貼壁細(xì)胞加IP裂解液或RIPA裂解液用細(xì)胞刮板移至1.5ml離心管;懸浮細(xì)胞收集細(xì)胞至離心管離心去除培養(yǎng)基,用PBS清洗離心去除上清再加入裂解液,預(yù)計(jì)提取蛋白以及BCA測蛋白濃度一上午的時(shí)間,估計(jì)上樣體積加入loading buffer煮蛋白置于-80℃保存;下午跑蛋白電泳,SDS-PAGE膠可于前一天晚上制好防止-4℃冰箱保存(用少量純水用封裝袋保存)或使用預(yù)制膠,大概1多小時(shí)蛋白maker跑到距離膠最下面1-2cm處停止電泳;轉(zhuǎn)模,根據(jù)目的蛋白的大小確定轉(zhuǎn)膜時(shí)間和毫安數(shù),結(jié)束后裁膜用5%脫脂奶粉封閉,之后孵育一抗4℃過夜,第二天洗膜孵育二抗并進(jìn)行顯影,因此步驟時(shí)間熟練的話2天就可以完成一次WB實(shí)驗(yàn)。


    (2)預(yù)備方案:實(shí)驗(yàn)重復(fù)是不可避免的,因此預(yù)備下一周期實(shí)驗(yàn)方案(車輪戰(zhàn))有助于縮短時(shí)間提高效率,當(dāng)然,師兄師姐以及廣大學(xué)術(shù)里的經(jīng)驗(yàn)小tips也有助于提高實(shí)驗(yàn)效率。例如,在WB配制SDS-PAGE膠的凝固時(shí)間通常會隨季節(jié)溫度的變化而改變,夏季和冬季應(yīng)該時(shí)間就會產(chǎn)生差異(冬季凝固較慢),再者,AP 和TEMED 作為促凝劑,一般都是最后加入,尤其是AP(過硫酸銨)。實(shí)驗(yàn)之前我們可能都會設(shè)計(jì)一個(gè)預(yù)期結(jié)果,我們可以在上一周期實(shí)驗(yàn)的空余時(shí)間預(yù)備下一周所需要的實(shí)驗(yàn)條件,例如重新細(xì)胞鋪板給藥等待時(shí)間周期等等。


    2.提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的質(zhì)量:減小系統(tǒng)誤差,消除人為錯(cuò)誤

    ①減小系統(tǒng)誤差:一般設(shè)計(jì)3個(gè)重復(fù)孔,但是后期我統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)時(shí)發(fā)現(xiàn),誤差bar仍可能較長,這時(shí)我們可以設(shè)計(jì)4個(gè)復(fù)孔,去除一個(gè)誤差最大的值也有助于結(jié)果的準(zhǔn)確性。這時(shí)就要求我們會更加精準(zhǔn)的使用移液槍。另外,重復(fù)實(shí)驗(yàn)也有助于提高我們加樣的準(zhǔn)確性。


    ②制備預(yù)混液:例如我要做30(2×5×3)孔兩個(gè)基因(包含內(nèi)參),5個(gè)處理,3個(gè)復(fù)孔,那么我的熒光染料一個(gè)孔需要5ul,正反引物2ul,那么我們可以再不浪費(fèi)試劑的情況下,計(jì)算量可為:15.5×5+15.5×2或者(15×5+15×2)×1.1,這一定程度上都是為了消除我們?nèi)藶榧訕诱`差。

    圖片


    ③另外我們盡量增大加樣體積減少誤差:針對于10ul體系,提前將正反引物混合,配制SYBY+正反引物和cDNA+ddH2O,這時(shí)的體積為6+4或者7+3可減少加樣體積小帶來的加樣誤差。


    ④相關(guān)試劑使用前需離心使用:另外,在八聯(lián)管上機(jī)前需要用干凈的手套蓋上透明蓋子,適當(dāng)離心將反應(yīng)體系離心至管底。


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