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    細(xì)胞培養(yǎng)常遇到的問題解決辦法

    發(fā)布時(shí)間： 2022-10-24　　點(diǎn)擊次數(shù)： 1257次

    養(yǎng)細(xì)胞是一件勞心勞力的事。要像照顧小孩一樣仔細(xì)對(duì)待，愛護(hù)它，呵護(hù)它。這次就來講講細(xì)胞培養(yǎng)常見問題的原因及解決辦法。




    1 培養(yǎng)液 pH 值變化太快


     原因：


    • CO2 張力不對(duì)

    • 培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊

    • NaHCO3 緩沖系統(tǒng)緩沖力不足

    • 培養(yǎng)液中鹽濃度不正確

    • 細(xì)菌、酵母或真菌污染


     解決辦法：


    • 按培養(yǎng)液中 NaHCO3 濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi) CO2 濃度，2.0 g/L 到 3.7 g/L 濃度 NaHCO3 對(duì)應(yīng) CO2 濃度為 5％ 到 10％。或者改用不依賴 CO2 培養(yǎng)液

    • 松開瓶蓋 1/4 圈

    • 加 HEPES 緩沖液至 10 到 25 mM 終濃度

    • 在 CO2 培養(yǎng)環(huán)境中改用基于 Earle’s 鹽配制的培養(yǎng)液，在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用 Hank’s 鹽配制的培養(yǎng)液

    • 丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌





    2 培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，pH 值不變


    原因：


    • 用洗滌劑清洗后殘留磷酸鹽將培養(yǎng)基成分沉淀下來

    • 冰凍保存培養(yǎng)液


    解決辦法：


    • 用去離子水反復(fù)沖洗玻璃器皿，然后除菌

    • 將培養(yǎng)液加熱到 37 ℃，搖動(dòng)使其溶解如沉淀仍然存在，丟棄培養(yǎng)液





    3 培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，同時(shí) pH 發(fā)生變化


    原因：


    • 細(xì)菌或真菌污染


    解決辦法：


    • 丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌




    4 培養(yǎng)細(xì)胞不貼壁


     原因：


    • 胰蛋白酶消化過度

    • 支原體污染

    • 培養(yǎng)液中無貼壁因子


    解決辦法：


    • 縮短胰蛋白酶消化時(shí)間或降低胰蛋白酶濃度

    • 分離培養(yǎng)物，檢測(cè)支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物

    • 改變培養(yǎng)液成分


    5 懸浮細(xì)胞成簇




    原因：



    • 培養(yǎng)液中含鈣、鎂離子

    • 支原體污染

    • 蛋白酶過度消化使得細(xì)胞裂解釋放 DNA



    解決辦法：



    • 用無鈣鎂平衡鹽溶液洗滌細(xì)胞，輕輕吹吸細(xì)胞獲得單細(xì)胞懸液

    • 分離培養(yǎng)物，檢測(cè)支原體。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物

    • 用 DNase I 處理細(xì)胞



    6 原代細(xì)胞培養(yǎng)物污染




    原因：



    • 原代培養(yǎng)組織在進(jìn)入培養(yǎng)前已污染



    解決辦法：



    • 培養(yǎng)前用含高濃度抗生素的平衡鹽溶液反復(fù)沖洗組織培養(yǎng)前用含高濃度抗生素的平衡鹽溶液反復(fù)沖洗組織



    7 培養(yǎng)細(xì)胞死亡


    原因：


    • 培養(yǎng)箱內(nèi)無 CO2

    • 培養(yǎng)箱內(nèi)溫度波動(dòng)太大

    • 細(xì)胞凍存或復(fù)蘇過程中損傷

    • 培養(yǎng)液滲透壓不正確

    • 培養(yǎng)液種有毒代謝產(chǎn)物堆積


    解決辦法：


    • 檢測(cè)培養(yǎng)箱內(nèi) CO2

    • 檢查培養(yǎng)箱內(nèi)溫度

    • 取新的保存細(xì)胞種

    • 檢測(cè)培養(yǎng)液滲透壓。注意：大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞能耐受滲透壓為 260~350 mOsm/kg。加入額外試劑如 HEPES 或藥物都有可能影響培養(yǎng)液滲透壓。

    • 換入新鮮培養(yǎng)液


    8 培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)減慢




     原因：



    • 由于更換不同培養(yǎng)液或血清

    • 培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長(zhǎng)必需成分如谷氨酰胺或生長(zhǎng)因子耗盡或缺乏或已被破壞

    • 培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染

    • 試劑保存不當(dāng)

    • 接種細(xì)胞起始濃度太低，細(xì)胞已老化

    • 支原體污染



    解決辦法：



    • 比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)。讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液

    • 換入新鮮配制培養(yǎng)液。補(bǔ)加谷氨酰胺或生長(zhǎng)因子

    • 用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培養(yǎng)物。或用抗生素除菌

    • 血清需保存在 -5 ℃ 到 -20 ℃。培養(yǎng)液需在 2~8 ℃ 避光保存。含血清*培養(yǎng)液在 2~8 ℃ 保存，并在 2 周內(nèi)用完

    • 增加接種細(xì)胞起始濃度，換用新的保種細(xì)胞

    • 分離培養(yǎng)物，檢測(cè)支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物




    9 保存血清最合適的方法是？


    建議血清應(yīng)保存在 -5 ℃ 至 -2O ℃。然而，若存放于 4 ℃ 時(shí)，請(qǐng)勿超過一個(gè)月。若您一次無法用完一瓶，建議您無菌分裝血清至恰當(dāng)?shù)臏缇萜鲀?nèi)，再放回冷凍。





    10 如何解凍血清不會(huì)使其質(zhì)量受損？


    建議將血清從冷凍箱取出后，先置于 2～8 ℃ 冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融。但必須注意的是，融解過程中必須規(guī)則地?fù)u晃均勻。



    11 血清解凍后有絮狀沉淀物怎么辦？


    血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但最為普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白（形成凝血的蛋白之一）在血清解凍后，也會(huì)存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。


    但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質(zhì)量。若欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無菌離心管內(nèi)，以 400 g 稍微離心，上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾。我們不建議您以過濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因?yàn)樗赡軙?huì)阻塞您的過濾膜。





    12 為什么要熱滅活血清？


    加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。激活的補(bǔ)體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在免疫學(xué)研究，培養(yǎng) ES 細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時(shí)，推薦使用熱滅活血清。



    13 有必要做熱滅活嗎？



    實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)過正確處理的熱滅活血清，對(duì)大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)只有微小的促進(jìn)，或*沒有任何作用，甚至通常因?yàn)楦邷靥幚碛绊懥搜宓馁|(zhì)量，而造成細(xì)胞生長(zhǎng)速率的降低。


    而經(jīng)過熱處理的血清，沉淀物的形成會(huì)顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是「小黑點(diǎn)」，常常會(huì)讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在 37 ℃ 環(huán)境中，又會(huì)使此沉淀物更增多，使研究者誤認(rèn)為是微生物的分裂擴(kuò)增。




    14 儲(chǔ)存冰箱中的胎牛血清出現(xiàn)沉淀？



    GIBICO 的胎牛血清沒有預(yù)老化，儲(chǔ)存在 2~8 ℃ 時(shí)，血清中的各種蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應(yīng)該不會(huì)影響血清的質(zhì)量。推薦在 -20 ℃ 儲(chǔ)存胎牛血清，避免反復(fù)凍融。




    15 如何避免沉淀物的產(chǎn)生？


    解凍血清時(shí)，請(qǐng)按照所建議的逐步解凍法（-20 ℃ 至 4 ℃ 至室溫），若血清解凍時(shí)改變的溫度太大（如 -20 ℃ 至 37 ℃），實(shí)驗(yàn)顯示非常容易產(chǎn)生沉淀物。


    解凍血清時(shí)，請(qǐng)隨時(shí)將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。


    請(qǐng)勿將血清置于 37 ℃ 太久。若在 37 ℃ 放置太久，血清會(huì)變得混濁，同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會(huì)因此受到損害，而影響血清的質(zhì)量。


    血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。若必須做血清的熱滅活，請(qǐng)遵守 56 ℃，30 分鐘的原則，并且隨時(shí)搖晃均勻。溫度過高，時(shí)間過久或搖晃不均勻，都會(huì)造成沉淀物的增多。



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